¿Cómo funciona la famosa prueba que hacen para saber si tienes ébola?

Mucha gente me ha estado preguntando sobre cómo se sabe si alguien tiene ébola, cuánto tarda la prueba, en qué consiste… Voy a intentar contestar a esas preguntas. Una vez más, y antes de empezar, quiero aclarar que lo voy a explicar a un nivel muy básico para que todo el mundo lo entienda. Para aquellos que podáis tener preguntas más avanzadas, sabéis que siempre me podéis preguntar, pero yo quiero escribir algo que la vecina del quinto, que no sabe lo que es el DNA sepa cómo funciona.

Habréis leído en los periódicos que se hace una PCR. ¿Pero eso que es? La PCR es la reacción en cadena de la polimerasa. Supongo que no ha aclarado mucho. Más o menos cuando yo nací, a un señor se le ocurrió como usar una polimerasa para hacer copias de DNA, o ADN como se le suele llamar en español. Hasta el momento se sabía que había unas proteínas, llamadas polimerasas, que hacían copias del DNA. El problema era cómo conseguir repetir el proceso muchas veces, porque para que esto funcione hace falta desplegar el DNA, y para eso hace falta calor, y estas proteínas no funcionan bien con el calor. Para vuestra siguiente pregunta, que va a ser que cómo se hace entonces en nuestras células, diré que es que nosotros tenemos otras muchas proteínas que ayudan en el proceso. Pero en un laboratorio queremos usar sólo una. Así a ese señor se le ocurrió coger la proteína de una bacteria termófila, que vive a temperaturas muy altas, y probar a ver si funcionaba. Y funcionó. Hoy en día tenemos una gran variedad de polimerasas de diferentes organismos, todos ellos termófilos, y que cada vez funcionan más rápido.

Lo que hay que hacer es poner en un tubo el DNA que quieres copiar, la polimerasa, dNTPs (son los nucleótidos, las “letras” que componen el DNA, y que la polimerasa va a ir eligiendo y uniendo a la cadena) y unos primers (cebadores) que son cadenas cortas que le sirven a la polimerasa para empezar a copiar. Estas cadenas son complementarias a los extremos de la zona que se quiere copiar, y sirven como inicio, porque la polimerasa no es capaz de empezar por cualquier sitio, necesita un pequeño trozo de cadena doble, y lo que hace es unirse al extremo e ir añadiendo letras a la cadena, copiando el molde, que es nuestro DNA de inicio. Así, tras varios ciclos, conseguimos millones de copias de algo de lo que teníamos muy poco. Para ello solo hay que ir calentando mucho (para que el DNA se despliegue), enfriando un poco (para que los primers se unan pero el DNA original no) y dejando un tiempo más o menos largo según el trozo de DNA que se quiera copiar. Esto se repite muchas veces hasta tener copias suficientes, y se hace en una máquina llamada termociclador (porque hace ciclos de calor…) en un tubo muy pequeño, con un volumen de unos 50 microlitros (una gota, vaya) y tardas entre una y tres horas según el DNA que quieras copiar y lo rápida que sea la polimerasa que uses.

Ahora volvamos al ébola. Yo os he explicado como se copia DNA, pero es que el ébola dicen en la tele que es un virus de RNA… ¿Entonces? Efectivamente, el ébola es un virus RNA, y tiene una única cadena, de polaridad negativa, para ser más exactos. Como para la PCR necesitamos DNA, lo que se hace es copiar primero el DNA a RNA. Esto lo hace otra proteína, que se llama transcriptas a inversa. La transcripción es el proceso por el cual el DNA se copia a RNA mensajero, que luego se va a utilizar para hacer proteínas. Cuando se descubrió la proteína que hacia lo contrario, pasar el RNA a DNA (en este caso se le llama cDNA, por complementario), se la llamó transcriptasa inversa. Esta reacción es mucho más sencilla porque necesitamos hacerla solo una vez, para tener un molde para la PCR.

Ahora vamos a la prueba que se hace. He intentado encontrar toda la información posible pero el gobierno de España no aporta demasiada información. El de Estados Unidos sí, así que os voy a contar el kit que usan ellos, que aunque a España nos lo pueda estar proporcionando otra compañía, funciona igual.

El kit que ha aprobado el gobierno de los Estados Unidos para la prueba es, ante todo, un agujero negro de información. Por supuesto, no te cuentan que lleva cada tubo que te venden, porque entonces no lo comprarías. Pero la información disponible es suficiente para que nos hagamos una idea.

Lo primero, el kit funciona a partir de una gota de sangre. Sólo necesitas una gota, y te permite detectar el virus incluso antes de que se muestren síntomas. Tengamos en cuenta esto, porque es un factor muy importante, ya que a nosotros nos están contando que si no hay síntomas no hay virus suficientes, pero eso es mentira. No es que los vayan a detectar a los cinco minutos de la infección, pero podría ser de ayuda detectarlo el día anterior a mostrar síntomas, para poder aislar lo antes posible.

El primer paso para el análisis es inactivar el virus. Así, su RNA va a seguir intacto, pero el virus ya no puede infectar al pobre científico que hace el análisis. Pese a ello, te repiten mil veces que lo hagas en un laboratorio con el nivel de seguridad adecuado. A continuación usas otro kit (uno muy común, que casi los que hemos trabajo con RNA hemos usado) para extraer el RNA. Funciona a base de romper las células y los virus y dejar suelto el material genético (DNA y RNA), se elimina el DNA, y el RNA se une a una resina en una minicolumnita, luego se lava para quitar lo que no se interesa y se eluye con agua o un buffer (tampón) en el que se maximiza la estabilidad.

La muestra de RNA obtenida es la que se usa para la PCR. El kit permite hace un “todo en uno” de forma que en el mismo tubo primero dejas que la transcriptasa inversa copie el RNA a DNA y después que la polimerasa haga copias. Además, funciona con la tecnología conocida como Taqman (algo que yo nunca he tenido el placer de usar) de forma que se usan unos primers que llevan una etiqueta que cuando se hace una copia emite fluorescencia. Así, al utilizar un termociclador que lleva un detector, puedes ir viendo en tiempo real cuantas copias se hacen, lo que además te permite calcular cuánto DNA tenias y por extensión cuántos virus había (a ojo, que aquí estamos hablando de decir si había billones o solo millones). Esto además permite ahorrar tiempo en visualizar la muestra tras la reacción, lo que los mortales que no tenemos acceso a eso hacemos cargando las muestras en un gel de agarosa que teñimos con un agente que se intercala entre el DNA y que brilla con luz ultravioleta (y que es altamente cancerígeno, dicen). Nosotros lo que hacemos es aplicar una corriente eléctrica, usar un marcador y ver el tamaño del DNA que se ha copiado, para ver si tiene el tamaño de lo que nosotros queríamos copiar (si hay banda y tiene el tamaño correcto, es que si). Con el sistema que usa el kit, en la pantalla del ordenador ves una curva en la que además de presencia o ausencia puedes ver cantidad.

Por supuesto, y que nadie lo dude, todo kit lleva sus controles. Los controles asegurar que todos los reactivos funcionen, que la muestra haya sido obtenida correctamente (para eso se mira la presencia de RNA humano), que la máquina no haya fallado… Vamos, es casi imposible que falle y no lo detectes en los controles. Por supuesto, siempre puede haber errores, y por eso la prueba se repite (cada vez que se hace la prueba se hacen varias, y se repiten al día siguiente).

En conjunto, desde la extracción de la sangre hasta obtener el resultado, dependiendo siempre de la agilidad en el traslado de muestras y la agilidad del científico trabajando con el supertraje de seguridad… No se debería tardar más de seis horas en obtener el resultado.

¿Y que miramos exactamente? Podría decir que miramos si había RNA del virus del ébola y dejarlo ahí, pero sería poco específica. El kit no especifica que es lo que amplifica en el RNA. Yo, y esto es mi suposición, asumo que se amplifica el gen de la nucleoproteína, o al menos un trozo del mismo. Lo supongo porque es la proteína más abundante y la más conservada, por lo cual entiendo que es la mejor diana para detectar el virus, pero no hay información disponible, y supongo que está protegido por patentes. Sí puedo decir que la mayor parte de estudios publicados sobre detección de ébola usan ese gen.

Ya por último, lo que a muchos os interesa. He buscado los precios de varios kits de ese estilo (algunos disponibles al público general), tanto el de la PCR como el de purificación de RNA, y hecho una estimación. Asumiendo que cualquier laboratorio tiene al menos un termociclador, incluso la mayoría pueden acceder a uno que mida la fluorescencia… El precio en reactivos por un test es de menos de 10 euros. Ahora, que alguien me explique por qué estamos midiendo la temperatura en lugar de hacer un test diario a todos los posibles infectados.

Espero haber servido de ayuda a aquellos que no estaban entendiendo nada. Los que entendéis disculpadme, pero esto no iba para vosotros. Dádselo a vuestros padres, a vuestros abuelos, al panadero de la esquina. Y por supuesto, como sé que no he entrado en detalle y que quedan muchas dudas, y que me he dejado mil cosas por el camino, preguntad lo que sea y puedo ir actualizando y mejorando los datos.

Por si alguien tiene la paciencia (a mi me ha llevado un rato) y quiere leerse todo el manual del kit: enlace al pdf publicado por la FDA.


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Comentarios

  1. Avatar de grodira

    Reblogueó esto en grodiray comentado:
    Aprende cómo se detecta el ébola y cómo funciona una PCR en tiempo real de forma fácil.

  2. Avatar de peregringlk
    peregringlk

    Pues yo no lo he entendido. Los preámbulos todo, pero en cuánto te has puesto a hablar del proceso específico para el ébola no lo he entendido. El núcleo de la cuestión es el tema de las copias: el RNA del virus se transforma a DNA para que la polimerasa pueda actuar y realizar copias, pero, ¿y si no había virus en la sangre? Es decir, has pasado de: hechamos una gota de sangre para ver si está infectada, y al siguiente párrafo: lo primero es inactivar al virus. Has dado un salto de premisa a hecho que me ha dejado un poco trastornado.

    Por otro lado, si la polimerasa es quién está realizando copias de DNA, ¿por qué la cantidad de copias nos debe decir algo sobre la presencia del virus?

    1. Avatar de KaRMe

      Si no había virus en la sangre, la prueba da negativo. Sabes que ha funcionado porque a la vez miras la presencia de algo que siempre esté en una muestra humana, y así sabes que no es que la reacción haya fallado.

      La inactivación hace que el virus no pueda infectar, pero no destruye el RNA, por lo que la prueba funciona igual.

      La prueba va midiendo la fluorescencia emitida por los primers que se usaron, según se van “gastando”, esa fluorescencia aumenta. Como la reacción es exponencial, te permite saber cual era la cantidad de copias a tiempo cero, y por lo tanto la cantidad de virus en la muestra.

      Y gracias por las preguntas. Sabía que me dejaba cosas por el camino y agradezco que me deis la oportunidad de aclararlas.

  3. Avatar de Lulaluby
    Lulaluby

    Muchas gracias por la explicación…em serio,muy útill y revelador!

  4. Avatar de Pitágoras
    Pitágoras

    Muy interesante la explicación, pero realmente no dices nada de que es exáctamente lo que determina la presencia de ébola, si se mira en una tabla un conteo de “algo” concreto del resultado, si es un porcentaje de ese “algo”, si es un color final de la solución, vamos… nada de nada.

    1. Avatar de KaRMe

      Si, he dicho que se mira la fluorescencia. Cada vez que se hace una copia se emite fluorescencia, que el detector del termociclador registra. Se mira una gráfica que debe crecer exponencialmente, y de la que se puede extrapolar la concentración inicial de virus.

  5. Avatar de Zolo
    Zolo

    peregringlk, la inactivación del virus impide que el virus se pueda ser infeccioso actuando sobre las proteínas que forman la cápside del virus, pero dejando intacto el RNA. Esto permite seguir el proceso sin riesgo de infección.

    El texto está bien, pero se echa en falta algún que otro esquema para seguir bien la explicación.

    Un saludo.

    1. Avatar de peregringlk
      peregringlk

      Gracias Pablo. Entonces entiendo que las polimerasas solo van a duplicar DNA viral, y además, DNA de ébola, ignorando clonar cualquier otra porción de DNA que haya en la sangre. ¿No?

      1. Avatar de KaRMe

        No había llegado yo abajo y contesté en el comentario previo… Si, los primers se diseñan de forma que se unan específicamente a un trozo concreto del DNA que se ha generado con la transcriptasa inversa. Así te aseguras que lo que pones vaya a servir solo como iniciador para la copia de lo que quieres amplificar. Piensa por ejemplo que quieras mirar si hay un trozo concreto de 200 bases: usas como primers secuencias que sean las 20 primeras y las 20 últimas, y solo va a funcionar la reacción si tienen una cadena complementaria a la que unirse. Siempre vas a buscar un trozo que no se pueda unir a otra cosa parecida, y para eso antes coges esa secuencia y comparas con bases de datos para ver que no puedan unirse por accidente, por ejemplo, a un trozo de DNA humano.

    2. Avatar de peregringlk
      peregringlk

      Perdona Zolo, muchas gracias a tí también por tu respuesta jaja pero éste último comentario de abajo iba para Pablo, que me he equivocado y lo he colocado aquí.

    3. Avatar de KaRMe

      Soy consciente de la falta de un esquema, pero ni encontraba algo que me convenciese ni podía plantearme hacerlo yo. Es un blog personal que normalmente recibe cuatro visitas… En cualquier caso, si hay dudas, puedo aclararlas, y si puedo darte enlaces a sitios que explican el proceso general de forma gráfica. Lo que pretendía era explicar un poco este caso en concreto (más para mis conocidos que otra cosa, no esperaba tal repercusión) y también dar un poco una idea para que después cada uno pueda buscar o preguntar más. En cualquier caso, gracias por la lectura y el comentario.

  6. Avatar de andresrguez

    Reblogueó esto en Ciencias y cosasy comentado:
    La prueba para detectar el ébola costaría unos 10 euros mediante una PCR en tiempo real de forma fácil.

  7. Avatar de Pablo
    Pablo

    Referido a la pregunta que formula peregringlk:
    No sé si he entendido bien tu pregunta. Creo que lo que ocurre es que se hace la prueba “suponiendo” que hay infección y por tanto presencia de virus, por eso ha comentado lo de la inactivación del virus y la extracción de su RNA. Obviamente, si no hay presencia de virus en la muestra de sangre, al llevar a cabo estos procesos y luego la PCR para amplificar el ADN del virus, no se amplificará ningún gen, siendo por tanto imposible observar señal de fluorescencia. Esto significa que no hay virus en sangre, lo que se conoce como “resultado negativo en ébola”, es un resultado negativo del virus (y una buena noticia para la persona).
    No sé si me he explicado. Espero no haberme equivocado en mi interpretación.

    1. Avatar de peregringlk
      peregringlk

      Gracias Pablo. Entonces entiendo que las polimerasas solo van a duplicar DNA viral, y además, DNA de ébola, ignorando clonar cualquier otra porción de DNA que haya en la sangre. ¿No?

      1. Avatar de Pablo
        Pablo

        Exacto, así debería ser, o al menos así funciona una PCR convencional. Los primers (cebadores) son diseñados para unirse específicamente al ADN viral, y a partir de ahí la polimerasa puede replicar el ADN del virus, y sólo del virus. Si en la muestra de sangre no hay ADN viral, los cebadores no se unen a ese ADN, y por tanto la polimerasa no puede realizar copias. Como consecuencia no se obtiene señal de fluorescencia y el resultado es negativo en ébola.
        Si estoy equivocado que me corrija alguien, ya que en el caso concreto del Ébola, no es fácil saber exactamente cómo funciona el kit.

    2. Avatar de peregringlk
      peregringlk

      Muchas gracias por tu aclaración final. Te recomendaría que añadieses esa puntualización a tu entrada, porque creo que es importante.

      1. Avatar de Pablo
        Pablo

        Ok, gracias por la apreciación. ¡Un saludo!!

    3. Avatar de Pablo
      Pablo

      La clave es que los primers (cebadores) son diseñados para unirse específicamente al ADN viral, y a partir de ahí la polimerasa puede replicar el ADN del virus, y sólo del virus. Si en la muestra de sangre no hay ADN viral, los cebadores no se unen a ese ADN, y por tanto la polimerasa no puede realizar copias. Como consecuencia no se obtiene señal de fluorescencia y el resultado es negativo en ébola.
      Si estoy equivocado que me corrija alguien, ya que en el caso concreto del Ébola, no es fácil saber exactamente cómo funciona el kit.

      1. Avatar de KaRMe

        La puntualización es correcta, si, ya he intentado aclararlo en los comentarios anteriores. Gracias por los comentarios, ya sabia yo que se me olvidaba aclarar algo en el proceso.

  8. Avatar de asmatic

    Ya solo por curiosidad, y siendo lego en estos temas: como de específicos son los tests? Otros virus de la familia de los filovirus peden dar positivo por ejemplo?

    1. Avatar de KaRMe

      No lo sé porque no sé que es lo que amplifican exactamente. Asumo que no, que sólo ébola. En si dicen que es específico para la cepa Zaire, así que entiendo que incluso otro ébola no daría positivo.

      1. Avatar de asmatic

        De lo que entiendo que se tienen secuenciado todo el ARN de virus (y variantes del ebola) y pueden apuntar a las secuencias exclusivas de cada cepa.

        Muchas gracias!

        1. Avatar de KaRMe

          Si si, hay varias secuencias disponibles para contrastar. No habría querido ser yo la becaria que pringase con esas secuenciaciones… Ni me imagino la presión!

  9. Avatar de Caresth
    Caresth

    Yo creía que se buscarían anticuerpos -proteínas- que genera el enfermo. Si lo que se busca es directamente el virus ¿se le podría haber hecho esta prueba al famoso perro? Yo creía que no, pero ahora me dejas con la duda.

    1. Avatar de KaRMe

      También se hacen (o se pueden hacer) ELISAs para detectar anticuerpos. Hasta donde he podido saber, es una de las alternativas que dan para hacer la prueba en los hospitales españoles, pero la PCR es simplemente más sencilla y mucho menos peligrosa, ya que manipulas muestras muchísimo más pequeñas.

      El tema perro… Es complicado. Por una parte, si, si tuviese virus suficientes podían haberle hecho la prueba. Por otra parte si asumimos que no desarrolla la enfermedad y que puede multiplicar (o no) virus a una velocidad más baja, la cantidad podría estar por debajo del umbral de detección. Pero vamos, yo creo que lo del perro ha sido un intento de deshacerse del problema rápido, porque habría sido muy útil mantenerlo vivo y analizarlo para poder saber (en caso positivo) que hay que eliminar a todos los perros de las zonas del brote. Ha sido un despropósito, y aunque en España no tuviésemos instalaciones, estoy segura de que centros de otros países se habrían hecho cargo del traslado y todo, con tal de mantener al perro vivo.

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