Ingeniería con proteínas de fagos

Hoy vamos a hablar de como utilizar la ingeniería de proteínas para utilizar las de los fagos para matar bacterias. El artículo que voy a comentar hoy, publicado en Scientific Reports, es algo que me toca de cerca, así que espero no ponerme demasiado técnica. Prometo que es un tema sencillo y que es algo que podría sernos muy útil en el futuro.

Las proteínas de los fagos

Cuando un bacteriófago (fago), un virus que ataca bacterias, se une a su superficie, lo hace con las fibras. Las fibras son lo que todos vemos como patitas. Eso le permite unirse, pero a veces esas fibras o espículas también son capaces de alterar la parte externa de la bacteria. Un fago, al fin y al cabo, tiene que pinchar la superficie de la bacteria para poder inyectar su material genético. Después de inyectarlo lo copia y con él hace sus proteínas. Una vez que tenemos los faguitos ensamblados dentro, otra proteína diferente le va a servir para salir: las endolisinas. Son proteínas que rompen la cubierta para que los fagos puedan salir al exterior e ir a infectar otras bacterias.

Desde hace ya bastantes años, estas endolisinas se usan purificadas para romper las bacterias artificialmente desde fuera, pero ésto solo vale con las bacterias Gram positivas. Las Gram negativas tienen una membrana externa que las bloquea, y algunas de las bacterias de las que nos queremos deshacer son de este tipo, como por ejemplo Escherichia coli o Pseudomonas aeruginosa.

Uno de los fagos modelo es el fago T5. En su caso, se conoce muy bien tanto la proteína que se une (pb5), como la endolisina. He de decir que pb5 está en medio de la base de la cola, y que T5 también tiene “patas” formadas por pb1, pero eso era tema de mi tesis… a lo que iba, pb5. Pb5 se une a la proteína FhuA en la superficie de la bacteria, que también es algo muy conocido. Así que a partir de aquí, los investigadores empezaron con su corta y pega.

Los resultados de la “ingeniería”

Anteriormente, ya se habían hecho otro tipo de quimeras proteicas, así que su idea podría funcionar. Lo que hicieron fue fusionar la endolisina (que rompe desde dentro) a la pb5 (que se une desde fuera), de diferentes formas, unidas por fragmentos más grandes o más cortos, y con todo pb5 o sólo la parte necesaria para la unión. Esto es lo que viene siendo la ingeniería de proteínas de fagos. Comprobaron que efectivamente, las quimeras funcionaban en las bacterias no protegidas (o sea, las Gram positivas), así que no habían alterado la actividad de la endolisina. A estas quimeras (que yo seguiré llamando quimeras por ahora), las llamaron innolisinas.

A continuación, se centraron en su capacidad para alterar el crecimiento de las bacterias protegidas (las Gram negativas). Para ello usaron E. coli. Aunque no todas las quimeras funcionaron, sí encontraron diferentes niveles de actividad, y seleccionaron la que iba mejor: las bacterias crecían 10 veces más despacio (porque parte se morían). Con esta nueva quimera comprobaron además que dependía sólo de que se pudiese unir a FhuA en la célula, y que no dependía de que las células estuviesen creciendo activamente. Por microscopía, pudieron ver que, efectivamente, las células se rompían.

Por ahora tenemos una quimera (perdón, innolisina) que funciona en E. coli. ¿Y en otras bacterias? Comprobaron su actividad en Shigella sonnei y en Pseudomonas aeruginosa, dos bacterias que tienen una FhuA parecida a la de E. coli, y en ambos casos seguía funcionando, con una eficacia similar.

Por último, para mejorar lo que tenían, probaron a seguir utilizando pb5 pero utilizar otras endolisinas diferentes, que vienen de otros fagos. Curiosamente, al comprobar su actividad, no sólo eran más eficientes (100 en lugar de 10 veces) en bacterias “normales”, es que además podían reducir el crecimiento más de 1000 veces en bacterias resistentes a los antibióticos más modernos.

¿Qué sacamos en claro?

A veces no hace falta reinventar la rueda, y usando proteínas completamente naturales, podemos resolver muchos problemas. En otros casos, una simple fusión de dos proteínas puede ser suficiente. Por supuesto, se puede generar resistencia. Pero desde luego este sistema puede extenderse para generar muchos tipos de innolisinas, mientras que con el desarrollo de nuevos antibióticos vamos un poco más lentos.

Lo que han publicado estos investigadores es una prueba de concepto, una demostración de que la ingeniería con proteínas de fagos es una opción. Y lo es, así que esperemos que pronto vayamos avanzando, que ya hemos visto que cuando se quiere, los ensayos clínicos pueden ir muy rápido. Si es que no sabéis lo que me alegra saber que las proteínas de mis queridos fagos son útiles…

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Postulados de Koch: ¿los cumple el coronavirus?

Si estamos pendientes del tema de moda, habremos escuchado algo sobre los «postulados de Koch«. Tras haber escrito hace unas semanas un comentario sobre los puntos que se destacan por parte del colectivo que se hace llamar «Médicos por la verdad» y haber desmentido algunas de sus afirmaciones, hoy voy a profundizar un poco en este tema. Porque vamos a ver… ¿qué tiene que ver el señor Koch con el coronavirus?

Robert Koch: el padre de la bacteriología

Efectivamente, Robert Koch se considera uno de los padres de la ciencia que estudia las bacterias. Bacterias, que no virus… porque Robert Koch vivió antes de que se estudiasen virus. Destacó principalmente por el descubrimiento y estudio de bacterias que en aquel momento suponían un grave problema para la sociedad. Quizá su trabajo más famoso fue el estudio de la tuberculosis, producida por Mycobacterium tuberculosis. Por su estudio le dieron el Nobel de Fisiología o Medicina en el año 1905. Pero no se quedó ahí… también describió la bacteria que provoca el cólera (Vibrio cholerae) y la que provoca el carbunco, que es en la que nos vamos a centrar ahora.

El carbunco, que muchos situaréis más como ántrax, lo produce una bacteria llamada Bacillus anthracis. Esta bacteria forma esporas muy resistentes, y por ello supone un riesgo si se utilizase como arma biológica. Koch demostró que el carbunco lo producía una bacteria, algo que hasta el momento se ponía en duda. En su análisis del carbunco detalló qué es lo que describe a un agente patógeno, que generalizó en varias charlas y es lo que conocemos como postulados de Koch.

En el artículo original describe los distintos puntos que veremos a continuación, pero los describe centrándose exclusivamente en el bacilo que provoca el carbunco. Para los curiosos, ese trabajo se publicó en el año 1876. El pdf está disponible en la web del Robert Koch Institute, eso sí, es el original en alemán. Pero aunque no sepáis alemán podéis ver lo descriptivo de los materiales para demostrar cómo era el bacilo… y nadie lo puso en duda.

Los postulados de Koch

Sabiendo quién es Koch y para qué los describió, podemos resumir los famosos postulados de Koch en:

  • El agente está presente en individuos enfermos, ausente en sanos y ausente en otras enfermedades.
  • Se puede separar y cultivar.
  • Tras cultivarse, puede volver a producir la infección si se inyecta en un individuo.
  • Si se vuelve a inyectar, el que se aisla debe ser igual que el original.

¿Cumple el coronavirus los postulados? Sí, sin duda.

En numerosos artículos científicos se han publicado resultados de cultivo de coronavirus SARS-CoV-2 en diferentes tipos celulares. Además, los virus de esos cultivos se han utilizado para reinfectar animales y reproducir la enfermedad. Por ejemplo, en este artículo en Nature se utilizó virus cultivado en células Vero para inyectarlo en monos. En este otro artículo en Cell Research se utilizó un protocolo similar.

Además, como ya no estamos en el año 1876, podemos hacer más cosas. El virus aislado se puede analizar con microscopía electrónica y podemos «verlo». Por ejemplo, una bonita imagen coloreada a posteriori la encontramos aquí.

Pero ya hace muchos años que estos postulados no sirven «para todo», porque sabemos que la lepra es una enfermedad contagiosa producida por un microorganismo pero durante muchísimos años fue imposible replicarla fuera de humanos (y tampoco es que ahora podamos reproducir los pasos de los postulados).

¿Valen los postulados de Koch hoy en día?

La verdad es que no demasiado, y es que hemos tenido que actualizarlos un poco, y ni así. Ya en el año 1996 se habló de ello para adaptarlos al conocimiento molecular del siglo XX. Según los «nuevos postulados moleculares de Koch»:

  • El agente tiene que tener un ácido nucleico característico presente en los órganos atacados por la enfermedad pero no en el resto.
  • El ácido nucleico desaparecerá cuando la enfermedad se cure.
  • El tipo de enfermedad debe corresponderse a la de otros agentes con secuencias similares.

¿Cumple los postulados moleculares el coronavirus? Sí. Se han aislado más de 80.000 virus de los que se han analizado las secuencias de ese ácido nucleico, por lo que sabemos cual es ese «ácido nucleico característico», sabemos que aparece un resultado PCR positivo en paralelo a la enfermedad y que pasa a ser negativo cuando se cura, y también que se parece a otros similares… lo que en 2003 llamamos SARS a secas.

Imagen del coronavirus de microscopía electrónica
Imagen del coronavirus

Los asintomáticos… ¿es ese el fallo?

El primer paso es determinar qué es un asintomático. Es alguien que no tiene síntomas de una enfermedad de forma subjetiva. Que yo me sienta mareada o no dependerá de lo que yo sienta, por lo que no podemos tener un «valor» a partir del cual algo cuenta o no como mareo. Una persona puede no tener absolutamente ningún síntoma o puede tenerlos muy leves y ser clasificado como asintomático. Pero vamos a asumir que realmente no hay ningún síntoma y que están como una rosa…

Entonces hay dos opciones. O bien la infección no progresa y nunca desarrolla síntomas, o pasados unos días va a más y sí los desarrolla. Pero lo que tiene que quedar claro es que nadie se muere «de coronavirus» de un día para otro sin tener síntomas antes.

Lo que los avances en la detección de microorganismos nos permiten hacer, es detectarlo «antes de». Podemos detectar niveles muy bajos que, efectivamente, no vayan a ir a más. Pero que también pueden desencadenar una infección grave. Además, sabemos que se puede contagiar antes de detectarse los síntomas, por lo que es razonable aislar a las personas en las que se detecte el virus para que, si la infección avanza, no puedan contagiar a otros. Pero sí, habrá personas que eliminen el virus de su cuerpo sin desarrollar en ningún momento la enfermedad que conocemos como Covid-19.

«Nunca se ha visto un virus que se contagie sin síntomas»

Esta afirmación es muy repetida… pero no es cierta. Aunque la mayoría de los que afirman tal cosa no han pasado las paperas porque fueron vacunados, las paperas se contagian antes de mostrar síntomas. Las paperas las produce un Paramyxovirus. Pero probablemente lo que sí han pasado muchos de los que afirman que es «lo nunca visto» sí han pasado la varicela. Yo tengo unas marcas que me la recuerdan. El Virus Varicela Zoster, un Herpesvirus, se puede contagiar varios días antes de que aparezcan los síntomas. Por eso se expandía antes de la vacuna, que no es que fuésemos a fiestas de la varicela. Así que no, el coronavirus no es ni mucho menos el único virus que se contagia antes de que aparezcan los síntomas.

¿Entonces nos quedamos con los postulados moleculares?

Yo no lo haría. Porque incluso esa serie de reglas, ya no nos valen. No nos sirven, por ejemplo, para los priones, que carecen de ácido nucleico, pero que provocan enfermedades como la tan famosa de las vacas locas. Por eso en estos momentos es muy difícil establecer una lista de criterios para un patógeno, y por eso no se le ha dado mayor importancia a si el coronavirus cumplía o no cumplía una lista de criterios escrita antes de saber qué eran los virus. Pero si hay que explicar que los cumple, pues se explica. Y si hay dudas, para ello tenéis los comentarios, que estaré encantada de comentar lo que sea siempre en base a las evidencias científicas disponibles.

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La hidroxicloroquina no funciona en el pulmón

Hoy vamos a analizar brevemente los resultados de uno de los estudios que ha demostrado que la hidroxicloroquina no funciona para evitar el progreso de la COVID-19. Aunque hay varios, este trabajo ha destacado por la sencillez y por uno de los autores, que aunque no sea el principal, llama rápidamente la atención. La sencillez se nota en el hecho de que no es común encontrar artículos en Nature que ocupen menos de una página. En cuanto a el autor que destaca, hablamos de Cristian Drosten, que es, para que nos entendamos, el equivalente a Fernando Simón en Alemania. El artículo, que es muy elegante, podéis encontrarlo aquí.

La hidroxicloroquina

Aunque la versión hidroxi se ha hecho más famosa, realmente en todo momento se ha hablado tanto de la cloroquina como la hidroxicloroquina, dos variantes de un tratamiento más que conocido para la malaria. Su modo de acción se basa en aumental el pH endosomal, lo que hace que el virus no pueda entrar… si depende del pH. Unos ensayos iniciales que se hicieron en células Vero apuntaban a que era un tratamiento efectivo y, desde entonces, se han registrado casi 100 ensayos clínicos (sorpresa, los resultados no iban por buen camino).

Molécula de hidroxicloroquina
Molécula de Hidroxicloroquina

El posible error

Como acabo de decir, aquellas primeras pruebas eran en células Vero, que es una línea celular con células del riñón. ¿Por dónde entra el virus? Por el riñón no, desde luego. Ahí está el punto clave, que es que aunque en las células del riñón un virus si entre por esa ruta dependiente del pH, en las células de las vías respiratorias lo hace por otra vía. En términos más técnicos, en células como las del riñón la catepsina L activa la espícula del virus para que pueda entrar (y eso depende del pH), pero en las vías respiratorias usa la serin proteasa TMPRSS2, que no depende del pH, y que además es esencial para la replicación posterior del virus. ¿Qué pasa si usamos la cloroquina en las células de las vías respiratorias?

Los resultados

Como ya se puede intuir a estas alturas de la narración, cuando los investigadores comprobaron el efecto de la hidroxicloroquina evitando la entrada del virus, sólo funcionaba en la famosa línea celular Vero. Si se utilizaban células pulmonares o se suplementaba las de riñón con la TMPRSS2, entonces el virus entraba aunque hubiese hidroxicloroquina. Esto indica que el bloqueo depende del tipo celular, y el que nos interesa es el pulmón.

De forma similar, también comprobaron si afectaba a la replicación dentro de las células. Como se había publicado antes, en células Vero funcionaba, pero no en las del pulmón. De nuevo, el efecto de la hidroxicloroquina era despreciable.

Las conclusiones

La hidroxicloroquina no sirve para nada. No lo dicen así, dicen que no tiene actividad antiviral en el tejido pulmonar, pero las cosas hay que decirlas directamente. Así que podemos concluir que todas esas personas (ya sabéis a quién me refiero) que han dicho que tomar hidroxicloroquina los protegía del virus, estaban perdiendo el tiempo.

Además, este trabajo destaca algo muy importante: no todas las células son iguales y hay que utilizar las correctas para cada ensayo. De nada nos sirve que funcione en el riñón si no va a funcionar en los pulmones, y posibilidad para comprobarlo en las células correctas existía (en sí, es algo que se criticó mucho en su momento). Una vez más vemos que, aunque unos resultados puedan parecer prometedores, si el experimento está mal planteado, de nada nos sirven. Por eso es tan importante el papel de los revisores antes de publicar un artículo.

Ahora, eso sí, podemos ir cancelando los estudios que todavía queden en curso con la hidroxicloroquina… si es que todavía queda alguno. Seguro que todos los que pedían que los gobiernos (el que fuere) se gastase una millonada en hidroxicloroquina ahora no reconocerán el error, pero es que por estas cosas los científicos solemos decir lo de “todavía no tenemos pruebas de que…”, porque aquí hay que dudar de todo, incluso de nuestra propia sombra!

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Nivel 2: los linfocitos T

Desde hace ya bastantes semanas se está hablando cada vez más de la inmunidad celular y su papel en las infecciones y la inmunidad contra el coronavirus. El pasado 15 de julio se publicó un artículo en la revista Nature que analiza la presencia de inmunidad celular en casos de COVID-19, la enfermedad causada por el SARS-CoV-2, comparando la presencia de estos linfocitos T contra el SARS-CoV-2 con la presente para el SARS-CoV-1 (hasta hace seis meses SARS a secas) y en personas que no han tenido contacto.

Antes de comenzar a analizar los resultados del artículo, vamos a hacer un repaso general de inmunología para todos los públicos.

La inmunidad celular y la inmunidad humoral

Generalmente, cuando hablamos de inmunidad, hablamos de los anticuerpos medidos, porque los anticuerpos se pueden medir fácilmente. Aunque generalmente se hace con pruebas de inmunoensayo como el ya famoso ELISA, es relativamente sencillo generar test rápidos efectivos, como los que tenemos en el mercado para el SARS-CoV-2. Pero esa inmunidad es la inmunidad humoral, la que está mediada por los anticuerpos que generan los linfocitos B. Es nuestra principal vía de defensa, pero no es la única, ni tampoco la más duradera.

Además de linfocitos B, tenemos linfocitos T, que son los que se encargan de la inmunidad celular. Las células CD4 y CD8, que quizá os resulten familiares, son tipos de linfocitos T. La respuesta celular es muy compleja. Resumiendo mucho el proceso, hay unos linfocitos que se encargan de atacar al patógeno (el virus en este caso) y destruirlo, otras que suprimen la respuesta cuando todo se ha limpiado y las que nos interesan en este momento: los linfocitos T de memoria. Éstos sirven de base de datos, y permiten ampliar la señal cuando hay una infección que se “recuerda”.

Cuando se ataca algo externo tenemos en general dos respuestas: la inflamación y la liberación de citoquinas, que van a ayudar a la destrucción. Aunque todo el mundo ha leído ya algo de la famosa tormenta de citoquinas, yo voy a nombrar a un tipo en particular que va a ser importante en el artículo: el interferón. Medir el interferón liberado nos va a permitir saber si hay una respuesta al contacto con un patógeno o con un fragmento de ese patógeno. Si ponemos un trocito del virus y se libera interferón, es que hay linfocitos T que se acuerdan de ese trocito del virus y por lo tanto, van a intentar eliminarlo.

Coronavirus al microscopio
Coronavirus al microscopio

El transfondo del artículo

Los momentos eureka no existen. Los artículos científicos suelen tener un razonamiento que ha llevado a los investigadores a hacer una serie de experimentos. En este caso, se sabía antes que a largo plazo, los linfocitos T son más importantes que los anticuerpos, y que además no tienen que ser tan exactos, porque suelen servir para virus “parecidos”.

Aunque ahora nos enfrentamos a un virus nuevo, el SARS-CoV-1 está muy estudiado. En su caso se sabe que los anticuerpos bajan a niveles que no se pueden detectar pasados un par de años, pero que los linfocitos T “se acuerdan” pasados más de 10 años. ¿Podrían esos linfocitos ser útiles para el SARS-CoV-2? Además hay fragmentos que son casi iguales a los de los coronavirus que causan resfriados comunes. ¿Esos servirían?

Presencia de linfocitos T en pacientes recuperados de COVID-19

Para saber si estos linfocitos están presentes, los investigadores analizaron muestras de sangre para ver si reaccionaban ante la presencia de fragmentos del coronavirus. Aunque sabemos que no siempre hay anticuerpos presentes, en este caso todas las muestras reaccionaban. Además, analizaron las células de la sangre para ver si liberaban interferón y, pese a que los resultados variaban dependiendo del fragmento del virus utilizado, prácticamente todas las muestras generaban interferón. Esa capacidad no correlaciona ni con la generación de anticuerpos ni con la gravedad de la enfermedad.

Presencia de linfocitos T en pacientes de SARS

Ya que los fragmentos identificados antes eran similares a los que en el pasado se habían identificado para el SARS-CoV-1, tenía sentido comprobar si los linfocitos presentes en la sangre de personas que habían pasado el SARS podían reaccionar a fragmentos del SARS-CoV-2. Efectivamente, pese a que el brote de SARS fue hace 17 años, los linfocitos T de la mayoría “recordaban” esos fragmentos, si se utilizaban regiones que son muy parecidas entre los dos virus. Por dar un número, en una región que el 94% es igual, 7 de 8 pacientes respondían.

Presencia de linfocitos T en pacientes no expuestos

En principio sería lógico pensar que si no se ha tenido contacto con ninguno de los dos SARS-CoV, no hay memoria posible. Sorprendentemente, la mitad de las muestras analizadas sí eran capaces de responder, aunque de forma diferente a diferentes fragmentos del virus. ¿De dónde viene esa memoria? Aunque no podemos saberlo seguro, es esperable que venga de contactos pasados con otros coronavirus humanos (resfriados) o incluso por contacto con coronavirus de otros animales que no llegan a afectarnos.

Curiosamente, aquellos pacientes que no habían tenido contacto reaccionaban mejor a fragmentos “tempranos” del coronavirus, los primeros que entran en la célula. Si tenemos en cuenta el ciclo del virus, tiene cierta lógica, porque se deshacen de ellos antes de poder desarrollar la infección, así que nunca llegan a estar expuestos a fragmentos de proteínas tardías, aunque esto es más una idea en el aire que algo demostrado.

Conclusiones generales

No debemos obsesionarnos con la idea de los anticuerpos y con su presencia o ausencia. Los anticuerpos desaparecen rápido, pero eso no quiere decir que seamos susceptibles a una reinfección. De la misma forma, la presencia de linfocitos T puede ser más que suficiente en algunos casos para luchar contra la infección, sin haber desarrollado anticuerpos. Todavía nos queda mucho por saber, tanto de la respuesta a este virus en concreto como de la inmunidad en general, pero vamos dando pasitos poco a poco.

Quizá estos resultados ayuden a explicar por qué en algunas poblaciones la sintomatología era más grave que en otras. Quizá ayude a entender por qué algunos grupos de edad muestran más síntomas que otros. Lo que queda claro es que no podemos tener una mente cerrada y hay que tener en cuenta otros animales y otros virus, porque no estamos solos en el mundo y quizá lo que nos ayude a protegernos mejor sea un virus que no tiene por qué salir del laboratorio en forma de vacuna. La naturaleza nos lleva años de ventaja, deberíamos observarla con más detalle.

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Visita a un laboratorio de diagnóstico de coronavirus

Por razones que no vienen al caso, la semana pasada tuve el placer de visitar un laboratorio de referencia para el diagnóstico de coronavirus. El laboratorio en cuestión se encuentra en Suiza, pero lo que voy a contar, sobretodo lo que ellos me contaron, aplica a todos.

Lo primero a aclarar es que el laboratorio no sólo se dedica al SARS-CoV-2. El laboratorio estaba ahí antes para diagnosticar otros patógenos, pero ahora tienen dedicada gran parte del laboratorio de forma exclusiva al coronavirus, lo que ha provocado retraso en el diagnóstico de otras enfermedades.

La entrada de muestras

Cuando se recogen las muestras en el hospital, el «palito» (torunda) que se utiliza para recoger la muestra nasofaríngea se mete inmediatamente en un tubo con un medio de transporte. Ese líquido mantiene la muestra en buenas condiciones hasta su análisis y evita el crecimiento de otros microorganismos. El tubo incluye los datos del paciente para poder hacer el seguimiento de la muestra. Cada muestra se mete en una bolsa para aislarla (por si el tubo estuviese contaminado o se abriese) y todas las bolsas en una caja que se lleva, en el caso de este laboratorio, dos veces al día del hospital al laboratorio.

La preparación de las muestras

Una vez que las muestras llegan al laboratorio, ahí hay que registrarlas. En cada una de ellas se quita la torunda (ya se ha soltado todo el material recogido al medio de transporte) y se añade un tampón de lisis. Ese nuevo líquido añadido va a destruir las proteínas presentes en la muestra y romper las células que se han recogido de nuestra mucosa, facilitando la liberación del material genético del virus.

El análisis más rápido

Mientras la capacidad del laboratorio de diagnóstico lo permita, se opta por la automatización. En este caso tienen dos robots que automatizan el proceso completo. Eso permite poner en ellos las muestras en bloques de 96, que son los huecos en las placas de análisis, todas ellas en sus tubos con su medio de transporte ya mezclado con el tampón de lisis. El robot tiene dos estaciones: la primera para la extracción del ARN y la segunda para la RT-PCR. Una vez que las muestras entran en el robot, el proceso completo requiere unas dos horas y media. Pasada la primera hora y media, pueden empezar con otras 96 muestras, ya que la zona del robot que hace la RT-PCR no es la misma que para la extracción.

Eso aclara que, por muy automatizado que esté el proceso, gran parte del tiempo requerido es para la extracción del material genético. Esa extracción permite eliminar todo lo que no sea ARN, desde las proteínas que ya hemos roto al añadir el tampón de lisis hasta el ADN que tenemos en la muestra (que viene de nuestras células). Para eso hay diferentes incubaciones y separaciones de los componentes. Una vez que sólo hay ARN, la RT-PCR consiste en un primer paso (RT) en el que se retrotranscribe el ARN a ADN, y una serie de ciclos de PCR que hacen copias de ese ADN. Las copias van marcadas de forma que se puede medir su cantidad y detectar su concentración directamente en la máquina.

El análisis un poco menos rápido

Cuando esos primeros robots se saturan, un laboratorio de diagnóstico tiene otras opciones. En estos momentos me consta que no están saturados, pero me han enseñado su plan B y C. El B llegaron a utilizarlo en el pico, en el que se hacían menos análisis que ahora pero también había menos laboratorios preparados para ello.

Ese plan B implica el mismo proceso que el análisis rápido pero con dos robots diferentes, ya que uno hace la extracción y otro la RT-PCR, y hay que trasladar manualmente las muestras de uno a otro. Esto es lo que se hace en muchos laboratorios de análisis a nivel mundial.

Termocicladores: máquinas para hacer PCR
Así son las máquinas que se usan para hacer PCR

El análisis lento

Si el método A y el B se saturan, queda una tercera opción. Y no, la PCR no es en ningún caso el problema. Si los otros se saturan lo que hay que hacer es la extracción de ARN de forma manual. Se utiliza un kit comercial con los reactivos necesarios, pero hay que añadir todo a mano y hacer las separaciones e incubaciones a mano, temporizador al lado. Esto es más problemático porque expone a los investigadores al virus durante más tiempo.

Los resultados

En cualquiera de los tres escenarios, los resultados se procesan en otra sala, accediendo a las gráficas de cada termociclador (máquina que hace la RT-PCR). Allí trasladan uno a uno los resultados de la máquina a la base de datos en la que se encuentra ya la información de cada paciente. Una vez recopilados, los trasladan a las autoridades cantonales (los cantones suizos tienen las competencias de sanidad). Las autoridades cantonales serán las encargadas de informar de los resultados a los pacientes: un correo electrónico con los resultados y una llamada de teléfono en caso de ser positivo.

Los cuellos de botella

Durante mi visita hice muchas preguntas, algunas muy técnicas. Una de las que puede resultar de interés general es el punto de saturación del sistema. Les pregunté cuales habían sido los cuellos de botella en el pico de la primera ola. Recordemos que se ha dicho mucho que si las PCR esto o lo otro… pero ya he dicho antes que el problema era la extracción. Efectivamente, según sus palabras, los dos puntos críticos que les impedían analizar más muestras se encontraban en los primeros pasos. En el laboratorio de diagnóstico, lo que a ellos les afectaba directamente era la escasez de kits para la extracción de ARN. Por otra parte, otro punto crítico se encontraba en los hospitales. La disponibilidad de torundas para la toma de muestras era limitada.

Resultados erróneos

También pregunté por sus resultados y la validación. Según las palabras del responsable de la unidad, el número de falsos positivos es muy bajo y normalmente se detecta rápidamente. Se deben principalmente a una contaminación durante la manipulación de las muestras.

Por el contrario, el número de falsos negativos es mayor, llegando en algunos lotes a pasar el 30%. En este caso se debe fundamentalmente a una toma de la muestra incorrecta, y se solucionaron rápidamente al repetir la prueba de ese paciente con una muestra nueva. Según el encargado, la necesidad de recogida de muchas muestras hace que a veces se vaya demasiado rápido y no se recoja suficiente muestra para el análisis. En ese caso se identifica muy rápido porque el control de ARN humano da negativo. Pero en otros casos se recoge muestra suficiente, pero no en el sitio correcto: si nos quedamos en la boca o en la parte externa de la nariz, quizá no haya virus suficientes para detectarlos, hay que ir más atrás.

Para solucionar estos problemas es imprescindible que el personal que recoge las muestras tenga la formación correcta, y también que haya personal suficiente, para liberar presión y tener tiempo suficiente entre muestra y muestra.

El nivel de bioseguridad

Toda la planta, absolutamente toda, incluyendo los pasillos y las oficinas, se encuentra en un nivel de bioseguridad 2. Esto implica que todo el personal ha recibido formación específica, se toman precauciones extra y el acceso está restringido (hace falta un permiso para acceder a él mientras se está trabajando). Además, los experimentos que implican al patógeno se hacen en campanas especiales. Obviamente, todo el mundo lleva mascarilla en todo momento, incluso en las oficinas estando solos.

Para un laboratorio de diagnóstico para el SARS-CoV-2 se recomienda un nivel de bioseguridad 3. Por eso, todo el trabajo que implica al virus antes de su inactivación, se hace en campanas de flujo laminar que extraen el aire filtrándolo al exterior, por personal formado en el trabajo con patógenos potencialmente mortales, con ropa especial y por supuesto, con equipos de protección personal.

Los otros diagnósticos

En este laboratorio también se hacen análisis serológicos tipo ELISA para la determinación de anticuerpos, y análisis poblacionales a pequeña escala… parecidos al ENE-COVID pero en un único pueblo, una residencia, etc.

El auge de otros laboratorios con capacidad diagnóstica les ha permitido poder expandir el tipo de estudios, haciendo más investigación y menos diagnóstico puro. Para que nos pongamos en contexto, este laboratorio está analizando unas 200 muestras diarias en estos momentos, que es aproximadamente un 5% de las que se realizan en todo el país.

Mis conclusiones

La visita ha sido muy interesante y me ha gustado mucho tener esa oportunidad. Todo el esfuerzo dedicado a poder acceder ha valido la pena, y además de lo que os he contado he aprendido mucho de aspectos mucho más técnicos que, como bioquímica especializada en interacciones entre bacterias y fagos, me interesaban especialmente. Quizá pueda volver en algún momento, y espero poder volver, porque eso indicaría que no se han saturado y todavía tienen tiempo para dedicarle a una mente curiosa como la mía.

En mis visitas a laboratorios no me podéis apoyar, pero me podéis ayudar a mantener este sitio activo. Si queréis hacerlo, podéis invitarme a un café.